BL21(DE3)

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感受态细胞基本信息

出品公司: NEB
感受态细胞名称: BL21(DE3)  Ultracompetent cells;BL21(DE3) 超级感受态细胞
菌种类型: E.coli
产品规格: 20X110 微升
转化效率: 大于1X10的9次方
基因型: BL21(DE3)感受态细胞基因型
抗性: 无抗性
质粒转化条件: 42 ℃热激
生长条件: 37 ℃,  有氧
用途: 非毒性蛋白表达。
储存条件: -70 ℃或者更低温度保存,避免反复冻融。

感受态细胞特点和简介

生物风生产的BL21(DE3)感受态细胞是采用大肠杆菌BL21(DE3)经过特殊工艺处理得到的感受态细胞,可以用于质粒的化学转化。使用pUC19质粒检测,转化效率可以高达108 CFU/ug,-70 ℃保存几个月转化效率也不发生改变。

大肠杆菌BL21(DE3)生长速度快,表达量高,是原核细胞蛋白表达最基础的菌株;

蛋白酶Lon和OmpT的缺陷型,能够有效减少对目的蛋白的降解;

适合IPTG诱导的T7启动子载体,常用的pET系列载体;

表达非毒性蛋白,有密码子偏好性。

感受态细胞制备方法

生物风在氯化钙感受态细胞制作方法的基础上进行了改良,采用最新的二价锰法感受态细胞制备方法,制备得到BL21(DE3)超级感受态细胞(Ultracompetent cell)。转化效率是常规氯化钙制备法的10倍。
 

感受态细胞操作方法

 
1. 取BL21(DE3)感受态细胞置于冰浴中,如需分装可将刚融化细胞悬液分装到无菌预冷的离心管中,置于冰浴中。
     注意:一次转化BL21(DE3)感受态细胞的建议用量为 50-100μl,可以根据实际情况分装使用。应注意所用DNA 体积不要超过感受态细胞悬液体积的十分之一。以下实验以100μl BL21(DE3)感受态细胞为例。 
 
2. 向BL21(DE3)感受态细胞悬液中加入目的 DNA (100μl 的感受态细胞能够被1 ng 超螺旋质粒DNA 所饱和),轻弹混匀,在冰浴中静置30 分钟。  
 
3. 将离心管置于 42 ℃ 水浴中放置60-90秒,然后快速将管转移到冰浴中,使BL21(DE3)感受态细胞冷却2-3分钟,该过程不要摇动离心管。
 
     注意:此步骤也可将离心管置于室温进行,时间不需十分准确,夏季或室温较高时,可放置5-8分钟左右;如果室温较低,可延长时间至8-15分钟左右。条件允许建议使用 42 ℃ 热激方法。  
 
4. 向每个离心管中加入900 μl无菌的SOC 或LB 培养基(不含抗生素),混匀后置于37 ℃摇床振荡培养45 分钟(150 rpm),目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达,使菌体复苏。 
 
5. 将离心管内容物混匀,吸取100μl已转化的BL21(DE3)感受态细胞加到含相应抗生素的SOB或者LB 固体琼脂培养基平板上,用无菌的弯头玻棒涂布器或玻璃珠将细胞均匀涂开。将平板置于室温直至液体被完全吸收后,倒置平板,37 ℃培养12-16 小时。 
     注意:涂布用量可根据具体实验来调整。如转化质粒总量较多,可取更少转化产物涂布平板;反之,如转化的质粒总量较少,可取200-300 μl转化产物涂布平板;对于连接产物的转化菌液,可以通过离心(4000 rpm,2分钟)后倒掉大部分培养液上清,吹打悬浮菌体后,将其涂布于一个平板中。  
 
6. 涂布剩余的菌液可置于 4℃冰箱中保存,如果次日的转化菌落数过少,可以将剩下的菌液再涂布新的培养平板。

感受态细胞注意事项

1. BL21(DE3)感受态细胞应保存在-70 ℃,不可反复冻融和放置时间过长,以免降低感受态细胞的转化效率。
 
2. 进行转化操作时,应根据相应的温度及无菌条件的要求进行。
 
3. 为防止转化实验不成功,可以保留部分连接反应液,以重新转化,将损失降到最低。
 
4. 用于转化的连接产物或质粒的体积不能超过感受态细胞体积的15%.  
 
5. 质粒超过7.5 kb后,随尺寸的增加转化效率会下降,质粒的尺寸超过10 kb时,在大肠杆菌增殖过程中也可能会出现质粒缺失现象;  
 
6. 用于转化的质粒量在0.1 pg~50 ng间的效果最好,超过50 ng质粒时,平板上单克隆数目会增加,但是转化效率会下降。 
 
7. 42 ℃热击时间与离心管的厚度、菌液的体积、转入片段的大小直接相关,一般建议热击60-90秒,热击时间不宜超过90秒,否则转化效率会下降很快; 
 

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